NIPT(新型出生前診断)はどうやって行っているの？

はじめに

NIPT(新型出生前診断)とは、「お母さんから採血した血液から胎児の21トリソミー(ダウン症候群)、18トリソミー(エドワーズ症候群)、13トリソミー(パトウ症候群)などの染色体異常を調べる検査」のことです。従来の血液による出生前診断と比較しても、感度・特異度から見ると検査自体の精度がきわめて高いとされています。妊婦の血液中には、赤ちゃんに由来するDNA断片が存在します。NIPTは、赤ちゃん由来のDNA断片を解析することで、出生前にこれらの染色体異常が赤ちゃんに存在しているかどうかの可能性を調べることができます。

NIPTのメリットとしては、これまでに出生前診断として行われている、子宮に針を刺す必要がある羊水検査や絨毛検査とは異なり、お母さんの腕から採血して行われる検査であるため、お母さんへの侵襲性(体へのダメージ)が低いだけでなく、これらの検査による流産のリスク(0.3〜1%)も皆無であることが挙げられます。更に、NIPTは検査の精度が高いことから、得られた検査結果から医師が疾患リスクの可能性を判断するために、信頼性の高い1つの指標として用いることができます。

ただし、NIPTの注意点として、NIPTはスクリーニング検査の一種であり、確定的な答えが得られる確定検査ではないということを理解する必要があります。あくまでも胎児がもつ染色体疾患のリスクが高いか低いかを、確率として調べるものとなります。そのため、NIPT検査を受ける前に、NIPTによって見つけられる染色体疾患やNIPTの原理、検査の仕組み、メリットや注意点について、医師と十分にご相談された上で、受験することが推奨されます。

本記事では、NIPTの原理から、NIPT検査を行う際の、お母さんから採取した血液がどのように検査されて解析結果が得られるか、NIPTの留意点についてご紹介します。

世界最高水準のNIPT

新型出生前診断（NIPT）とは、「お母さんから採血した血液から胎児の、21トリソミー（ダウン症候群）、18トリソミー（エドワーズ症候群）、1...

NIPT(新型出生前診断)の原理

NIPT(新型出生前診断)の原理としては、妊娠中のお母さんの血中に存在する胎児由来のDNA断片を採取して、そのDNA断片を機械(シークエンサー)で詳細に解析することで、胎児が21トリソミー、18トリソミー、13トリソミーなどの染色体疾患を有している可能性を検査します。妊婦ではなく胎児が染色体異常を有しているかどうかを確認し、胎児がこれらの染色体疾患に罹患している可能性を検査するためには、母体由来ではなく胎児由来のDNAを解析する必要があるため、母体血液中の胎児由来DNAがNIPT検査の検査対象となります。本項目では、NIPT検査に必要なDNA、シーケンサー、解析方法それぞれについてご紹介します。

NIPT(新型出生前診断)に必要なDNA

従来の出生前診断では、胎児由来DNAが含まれている羊水または絨毛を採取し、そこから胎児由来DNAの配列を確認することで、染色体疾患を有しているかどうかを判定します。

一方で、NIPT(新型出生前診断)では、母体の血中に存在する胎児由来DNAを利用します。本来、DNAは体内の1つの細胞(cell)内の核内に格納される形で染色体として存在していますが、DNA断片が血中にも流れ出てくることがわかっており、それがcell free DNA(cfDNA)と呼ばれています。NIPT検査では、このcfDNAを利用していますが、NIPTだけでなく、がんやその他の疾患の検査にもcfDNAが用いられており、cfDNA採取から判定までの流れは、信憑性や安全性の高い検査技術の1つと考えられます。

NIPT検査に用いられるcfDNAは、胎盤由来の胎児の血液が、母体の血中に流れ出てきているものに由来し、検査機関がcfDNAを抽出・DNA配列を解析して、得られた結果を基に、医師が出生前に胎児が染色体疾患を有している可能性を判定します。

シークエンサー

シークエンサーとは、DNAの配列(シークエンス)を読み取る機械を指しており、現時点では次世代シークエンサーNGS(New Generation Sequencing)と呼ばれる最新のものがあります。シークエンサーは、古くは1970年代にサンガー法と呼ばれる方法を用いたものがあり、基本的な仕組みはNGSになっても変わらず、抽出されたDNAの塩基配列を読み取っていくことが目的となります。

生物のDNAは、A(アデニン)、T(チミン)、G(グアニン)、C(シトシン)の4種類の塩基が配列されることで形成されていて、また、塩基は基本的にペアが決まっており、AとT、GとCが対になること(相補性)で、2本のDNAが結合した形(2本鎖DNA)の状態で存在しています。そして、それらが折り畳まれることで、染色体と呼ばれる構造が形成されて、1つ1つの細胞内の核と呼ばれる場所の中に格納されています。そして、DNAの中には特定の共通な塩基配列を持った部位が存在しており、正常な塩基配列かどうかを読み取ること(シークエンシング)で、遺伝子異常が発見されます。

シークエンサーの具体的な手法としては、まずは検体から目的のDNAを抽出・精製し、1本のDNAの状態にします。続いて、プライマーと呼ばれる特定の塩基配列を持った試薬が、目的の読み取りたい1本のDNA内に存在している塩基配列の末端に対となる形で結合します。その後、ddNTPと呼ばれるA, T, G, Cそれぞれに異なる色の蛍光が付加された塩基がミックスされた試薬と、DNAポリメラーゼと呼ばれる対となる各塩基をつなげて伸ばしていく試薬が協働して、1本にしたDNAに1塩基ずつ付加していくことで、元々の抽出されたDNAの遺伝子配列を読み取っていきます。

しかしながら、従来のシークエンサーを用いたシークエンシングでは、大きく2つの課題がありました。1つは、シークエンシング1回につき1本のDNAしか読み取ることが出来ず、複数の遺伝子異常を見つけるためには、複数箇所のDNAを抽出・シークエンシングをすることが必要となり、多くの時間と労力を要します。2つ目に、従来のシークエンシングには多くのDNA量が必要で、すなわちDNA抽出の段階で多くの検体量が必要になるため、cfDNAのような元々存在量が少ないDNAを読み取るには、例えば相当量の血液や組織ごと採取する必要があり、侵襲性が高く難しい状況でした。

そこで、これらの課題を解決すべく新しく開発されたものがNGSです。上述の1つ目の課題に対しては、NGSではDNAライブラリと呼ばれるDNAの目録を検査工程内で作成し、1回のシークエンシングで数百万から数十億単位のレベルでDNAの塩基配列を一気に読み取ることができます。つまり、従来のシークエンシングを1度に数百万回以上実施することと同じレベルのことができるようになっています。2つ目の課題に対しては、DNAをより効率的かつ多く抽出するための試薬・方法が開発されてきたことも寄与していますが、NGSであれば少ないDNA量でも塩基配列の読み取りが可能でcfDNAのような元々の存在量が少ないDNA量でも遺伝子異常を見つけることが可能になりました。

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解析方法

胎児由来cfDNAの解析方法として、従来から別の遺伝子解析にも利用されていたSNP解析(single nucleotide polymorphism：一塩基多型とも呼ばれる、1つの塩基が異なっている(例：正常であればAであるところがTになっている)かどうかを調べる方法)、マイクロアレイ解析(チップ(基板)の上に複数のDNA配列が並べられていて、そこに調べたい検体から得られたDNAを結合させることで、DNA量を検出する方法)等もありますが、MPS法(massively parallel sequencing)と呼ばれる解析方法が標準的とされています。

MPS法は、胎児由来cfDNAを利用したNGSでの解析と、各染色体由来の成分量の分析を合わせて実施します。すなわち、得られた胎児由来cfDNAの中で、どの染色体から由来してきたものなのかを、定量的に調べることができます。例を挙げると、胎児が21トリソミーである可能性が高い場合には、21番染色体が通常の2本より1本多い3本、つまり21番染色体から由来するDNA量も1.5倍(3÷2=1.5)多くなっているという結果が得られます。

ただし、NIPT検査に限らず他の遺伝子疾患を確認するための遺伝子検査でも同様に、何れの解析方法にしても100%の確証が得られるものは未だ無く、あくまでもスクリーニング検査であると考えるべきです。

NIPT(新型出生前診断)の検査の仕組み

NIPT(新型出生前診断)の仕組みとして、おおまかな流れとしては以下の通りです。

妊婦から採血→胎児由来cfDNAの抽出→ライブラリ調製→cfDNAのシークエンス解析→染色体異常の可能性判定

母体からの採血

具体的には、まずエコー検査で妊娠が確認できた妊婦の腕から10～20 mL(小さじ2杯から大さじ1杯程度)の血液を採取して、血液中に浮遊している胎児由来のcfDNAを抽出します。この時、もちろん母体由来のcfDNAも含まれているため、その点は留意する必要があり、後述します。

なぜ採血が必要なのか

母体からの採血は、羊水や絨毛を採取するような他の手法よりも侵襲性の低い方法であるからです。

胎児由来のDNAを採取する場合、胎児から直接組織や細胞が得られれば最も検査精度は高くなると考えられますが、直接採取は胎児に及ぼす危険が非常に大きく、母子ともに流産によるリスクを負うことにつながりかねません。そこで、母体の血中に含まれている胎児由来cfDNAを採取することで、胎児に影響を与えることなく、出生前診断が可能となります。

母体血液の遠心分離

母体血液から胎児由来cfDNAを抽出するには、母体血液を遠心分離機と呼ばれる機器で、各成分に分離させます。

私たちヒトの血液は、本来、液体成分(血漿：約55%)と細胞またはタンパク質等その他の成分に大きく二分され、それらが混ざり合った状態で全身を流れています。そこで、採血管に採取した血液を遠心分離することで、血漿・バフィーコート(血球細胞が含まれた薄い層として現れます)・赤血球の各層に分離させます。例えるなら、水と油を同じ容器に入れて放置しておくと、水と油は混ざり合わないので、水より重い油が下に沈むというイメージです。これは、通常病院や健康診断で行う血液検査で用いられる手法です。

各血液成分のうち胎児由来cfDNAは血漿に含まれており、バフィーコートや赤血球は母体由来のため、正確なNIPT検査を実施するために、検査準備の段階で、血漿のみを慎重に分取する必要があります。

結果の解析

結果の解析は、まず母体血漿中に含まれるDNA断片をすべて集め、特殊な標識を付けたライブラリを調製します。このライブラリをNGSでシークエンシングし(MPS法)、解析のステップで各々のDNA断片が何番染色体に由来しているかを同定します。

DNA断片から得られた遺伝情報を参照配列上に並べ替え、該当箇所の遺伝情報の多寡をカットオフ値（21番、18番、13番染色体の正常と異常を判断する基準値）と比較することで陽性・陰性・判定保留が決定されます。

ヒロクリニックNIPT検査では、プランによって違いはありますが、95%の方が8日以内に結果が判明しています。

これらの手順について、順を追ってご紹介します。

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シークエンス

前述の通り、NIPT検査ではNGSを用いて、胎児由来cfDNAをシークエンシングします。母体血漿中には母体由来cfDNAも含まれているので(一説には、妊娠10週頃では母体血漿cfDNAの内、約10%程度が胎児由来cfDNAと考えられています)、母体由来cfDNAと胎児由来cfDNAはまとめて網羅的にシークエンシングされることとなります。

具体的には、まずクリニックでのNIPTの説明動画の視聴・問診表・同意書記入・医師による診察・採血を行います。続いて、クリニックまたは認証機関において遠心分離により母体血漿を採取した後に、母体血漿からcfDNAを抽出してNGSによる網羅的なシークエンシングが実施されます。

同定

網羅的なシークエンシング(MPS法)が実施された後は、同定のステップに移ります。解析方法の項目で触れたように、胎児由来cfDNAがどの染色体に由来するものか定量的に測定することで、21, 18, 13トリソミーや、性染色体(生物学的上、男性であればX染色体およびY染色体を有しており、女性であれば2つのX染色体を有しています)の異常を検出することができます。また、性別判定を実施することも可能です。

判定

NIPTの判定に関しては、同定の項目部分にもあるように、定量的な測定により判定がなされます。DNAは目に見えるものではないため、数値化したデータと明確な基準が必要となります。

具体的には、NGSから得られたデータとカットオフ値を比較して判定されます。カットオフ値とは、端的に言えば基準値です。特定の数値を基準値として決めることで、その数値からどれだけ離れた数値が結果として現れたかで判定を行います。

例えば、健康診断で結果が返ってきた時に、「基準値」が範囲として記載されていて、その範囲外であれば「要検査」等と判定されているかと思います。同様にNIPT検査でも基準値(カットオフ値)を定め、これと照らし合わせる形で判定が行われます。

NIPT(新型出生前診断)の留意点

NIPT(新型出生前診断)は、出生前に胎児の染色体異常が確実に判明するものではなく、確率的に異常を持つ可能性が高いか低いかを判定する非確定的検査(母体血清マーカー検査なども含まれています)の1つとなります。そのため、NIPTの結果を受け、もしご自身の胎児が染色体異常を有している可能性が高いと判定された場合、確定診断を受けることが重要です。確定診断を受けるためには、確定的検査(羊水検査・絨毛検査)を受ける必要があります。また、その他のNIPTの留意点として、以下のようなものがあります。

胎盤性モザイク(CPM)

NIPTに用いられている母体血漿中に含まれる胎児由来cfDNAは、大部分が胎盤由来のもので、胎児に由来したcfDNAのみを検査しているわけではないことに注意が必要です。この特性上、胎児と胎盤との染色体核型が異なる場合（胎盤性モザイク(CPM)と呼びます）に、検査結果が胎児の染色体情報を正しく反映しないという事象が起こり得ます。

バニシングツイン

最初の段階で双子(ツイン)として妊娠し、妊娠の初期段階において片方の胎児が死亡して子宮内で吸収される現象をバニシングツインと呼びます。子宮内にて超音波検査等でも見えない状態(バニシング)です。この場合でも、亡くなってしまった胎児のDNAを検出する等、NIPTの結果に影響を及ぼす可能性が認められています。

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判定結果が「偽陽性」「偽陰性」「再検査(判定保留)」になる場合

基本的に、判定結果は「陽性」または「陰性」として報告されますが、「偽陽性」「偽陰性」「再検査(判定保留)」のいずれかになる可能性も完全に否定することはできません。

「偽陽性」とは、胎児が実際には健常であるにも関わらず陽性と判定されること、「偽陰性」は、胎児が実際には染色体異常を持っているにも関わらず陰性と判定されることです。

これらの結果報告となる理由としては、様々なものが存在しますが、大きく分けて母体や胎児に生物学的原因がある場合と、前述した胎盤性モザイク（CPM）の場合とが考えられます。母体や胎児に生物学的原因がある場合の具体例として、バニシングツインの影響、母体側での不顕性(症状として顕れない)の染色体異常、母体の臨床的な症状の状況による影響(腫瘍の存在、薬剤の影響、自己免疫疾患、臓器・骨髄移植など)が挙げられます。その他には検査の限界によるエラーなどが挙げられます。

現在のところ、国内の研究結果から、これらの結果となる割合は0.1〜0.3%程度であると考えられています。

まとめ

NIPT(新型出生前診断)は、出生前診断の1つとして、妊娠早期から行うことができ、簡便で侵襲性が低く精度の高い検査です。また、最先端の技術を用いていることから、今後も精度がより高まること、より少ない検体量での検査が可能になること等、さらなる改善が期待されます。

ご両親にとっては、これから産まれてくる子供に染色体異常があるかどうか、その不安を払拭するために価値のある検査であると考えられます。しかしながら、NIPTはあくまでも非確定的検査（スクリーニング検査）の位置付けであり、結果次第で侵襲性の高い確定的検査を受ける必要があること、いくつかの留意すべき点があることを考慮する必要があります。そのため、検査を受けるかどうかは、医師やカウンセラー等の医療スタッフと十分にご相談の上、決めることが重要です。